Indholdsfortegnelse
Formål 3
Teori 3
Hypoteser 5
Materialer 7
Fremgangsmåde 8
Resultater 10
Resultatsbehandling 12
Diskussion 13
Konklusion 14

Optimer dit sprog - Læs vores guide og scor topkarakter

Uddrag
Formål
Formålet med forsøget er ved brug af CRISPR-Cas9 til at forstyrre lacZ-genet i E- coli bakterien, hvorved den producere en fænotype, der gør den synlig gennem blå-hvid screening.

Denne blå-hvide screening teknik anvendes som en visel faktor til at se om lacZ-genet er redigeret med succes.

Teori
Hvad er CRISPR-Cas9 genredigering
Begrebet CRISPR refererer til et system, der findes i naturen, som gør det muligt for mikrober at forsvare sig mod virusangreb.

CRISPR (Clustered Regularly Short Palindromic Repeats) er sekvenser i genomerne hos nogle prokaryotes, der fungerer som en genomisk registrering af tidligere virusangreb.

Sammen med Cas-proteiner, bruger bakterierne sekvenserne til at genkende og afvæbne fremtidige invaderende vira. Forskere har tilpasset dette system til brug i genteknologi.

Cas9 er den genetiske saks, der blot skal vide, hvor den skal klippe henne, før den går i gang. Det får saksen at vide af et vedhæftet stykke RNA, som på grund af sin genetiske sekvens matcher givne DNA-sekvenser i andre organismer. Saksen klipper, hvor dens RNA-sekvens finder et DNA match.

---

lacZ-genet og blåhvid screening
Et gen i lac-operon, lacZ, koder for et enzym kaldt beta-galactosidase (β-gal), som katalyserer hydrolysen af lactose til monosaccarider.

Β-gal kan også hydrolysere sukkeranalogen X-gal, som producerer et blåt pigment, når den er hydrolyseret. Bakterier, der udtrykker funktionel β-gal, bliver blå, når de dyrkes i medier med X-gal.

I naturen er det laktose, der inducerer ekspressionen af lac-operon. Men eftersom lac-operon. Men eftersom lac-operon tillader bakterierne at bruge lactose selv som fødekilde optager de lactosen og ekspressionen stopper.

For at få en kontinuerlig ekspression af lacZ bruger forskere en ikke hydrolysebar lactoseanalog kaldet IPTG i vækstmediet.

E. coli
Den bakteriestamme der benyttes i dette forsøg, E. coli har naturligt et funktionelt laZgen. Derudover er denne stamme genetisk modificeret til at udtrykke Cas9 og den har et plasmid, der muliggør HDR.

Ekspressionen af HDR-DNA reparationssystemet kontrolleres af en arabinose inducerbar promotor; når bakterierne får arabinose “tænder” de for HDR-DNA reparation maskineriet.

Kun når det er tændt kan bakteriecellerne bruge donor-template-DNA’et til at reparere det dobbeltstrengede brud.

I lighedmed andre laboratoriestammer af E.coli er denne stamme modificeret, så den ikke kan benytte NHEJ, for at øge sikkerheden for forsøget.

Plasmiderne
Bakterien producerer nromalt ikke hverken sgRAN og donor-skabelin DNA, der kræves for at redigere lacZ-genet.

I forsøget introduceres sgRNA og/eller donor-skabelon DNA ved at transformere bakterier med et af to plasmider - hvor begge plasmider indeholder et resistensgen mod spectinomycin (SPT):

● pLZDononr - (kontrol) inkluderer en donor-skabelons DNA-sekvens, der vil blive brugt af HDR maskineriet til reparation af dobbeltstrengede DNA-brud.

Donor-skabelon DNA inkluderer en indsatssekvens, som indsættes i lacZ-genet og forringer dets funktion.