Indholdsfortegnelse
Formål:
Teori:
Materieller:
Forsøgs generelle fremgang:
Trin 1: Koloni PCR (Polymerase Chain Reaction)
Det der skal bruges:
1. Primere
2. Template DNA:
Trin 2: Skæring af DNA med restriktionsenzymet MboI Baggrundsviden:
Trin 3: DNA-gel elektroforese
Forsøgsresultat:
Efterbehandling:
Diskussion:
Konklusion:
Uddrag
Formål:
At anvende koloni PCR til at opnå et DNA-fingerprint for de bakterier der har inficeret to af patienterne samt de fundne høns og dermed bestemme, hvilke bakterier og behandlingsmuligheder der skal være tale om.
Teori:
Vi benytter PCR til at opformere et stykke DNA der ligger i 16S rRNA (ribosomal RNA) DNAet.
Denne region findes i alle mikroorganismer og kendetegnes ved at varierer meget i størrelse og sekvens.
Man udnytter at regionen indeholder både konserverede og ukonserverede regioner til at designe primere som kan binde i alle mikroorganismer, men også hvis PCR-produkt vil variere i længde og sekvens.
Således kan mikroorganismer identificeres ud fra det genetiske fingeraftryk som bakterien sætter i form af et DNA fragmentmønster ved skæring af PCR-produktet med et restriktionsenzym.
Skæringerne vil derefter blive analyseret på en gel. Er vores patienter blevet inficeret med samme virus/bakterie, så vil DNA-stykkerne give samme mønster i gelen, og man vil på den måde kunne sammenligne de forskellige prøver.
Materieller:
• Template DNA fra bakterien vi har varmet (som ønskes opformeret og som indeholder strækninger, der er komplementære til primerne)
• Primere (valgt så de amplificerer det rigtig stykke DNA som vi ønsker at opformerer )
o 10 μM Forlæns Primer (341F)
o 10 μM Revers Primer (907R)
• Nukleotider (til at bygge ny DNA af)
o dNTP mix, 2 mM each
• DNA polymerase (enzymet der bygger ny DNA)
o DreamTaq DNA polymerase
• Buffer (der sikrer de optimale betingelser fx sikrer optimal pH og salinitet)
o DreamTaq buffer
o Fastdigest Green buffer
• Eppendorfrør, Mikropipette, Pipettespids , Destilleret og sterilt vand, MboI fortynding , Termoblok, PCR-maskinen, 2% agarosegel i et elektroforesekar med TBE-buffer, 5 µl DNA-markør, UV-lys
• Bakterier koloni